甲型流感病毒H1N1亞型雙重探針法qRT-PCR試劑盒

Influenza Virus A H1N1 Duplex Probe qRT-PCR Kit

使用手冊V1.0

產品及特點

流感病毒分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒最容易發生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現新亞型或舊亞型重現引起的。甲型流感病毒是A型流感病毒，根據H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為18個亞型(H1~H18)，N可分為11個亞型(N1~N11)。其中導致人類感染甲型流感病毒主要是H1N1。人感染甲型流感病毒后的早期癥狀與普通流感相似，包括發熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發冷和疲勞等，有些還會出現腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發紅等。由于人群對甲型流感病毒普遍易感，并可以人傳染人，因此快速檢測甲型流感病毒H1N1亞型對甲型流感病毒的及早發現，避免其大范圍傳播具有重要意義。本產品就是以探針法qRT-PCR技術為基礎開發的對甲型流感病毒H1亞型和N1亞型的分型檢測的試劑盒，它具有下列特點：

1.                      即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2.                      引物和探針經過優化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/反應。

3.                      提供陽性對照，便于排除假陰性結果。

4.                      特異性高，引物和探針分別根據甲型流感病毒H1亞型和N1亞型RNA高度保守區設計，不會跟其他生物的RNA發生交叉反應。

5.                      既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6.                      兩個探針分別用FAM和HEX標記，檢測和分型同時完成。

7.                      本產品足夠50次20 mL體系的探針法RT-PCR反應。

8.                      本產品只能用于科研。

規格及成分

本產品使用十孔盒包裝

注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220 mL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。本試劑盒采用DNA作為陽性對照，不能有效監控核酸純化和RT過程。如果需要RNA模板，需要另外定做。

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。

自備試劑

樣品RNA，超純水

使用方法

一、       稀釋甲型流感病毒H1亞型檢測標準曲線樣品（以陽性對照10E1-10E6拷貝/mL這6個10倍稀釋度）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。

1.                      標記6個離心管，分別為A6，A5，A4，A3，A2，A1。

2.                      在A1-A6號管中各加入45 mL熒光PCR專用模板稀釋液。

3.                      在A6號管中加入5 mL 1×10E7拷貝/mL的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/mL的標準曲線PC樣品。放冰上待用。

4.                      換槍頭，在A5號管中加入5 mL 1×10E6拷貝/mL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/mL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.                      換槍頭，在A4號管中加入5 mL 1×10E5拷貝/mL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/mL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.                      重復上面的操作得到A1-A6共六個稀釋度的標準曲線陽性樣品。放冰上待用。

二、稀釋甲型流感病毒N1亞型檢測標準曲線樣品

7.                      操作同上，只是使用甲型流感病毒N1亞型的PC作為模板。得到6個濃度的樣本放冰上待用，分別是B1-B6。

三、樣品RNA的制備

8.                      如果有N個樣品，最好設置N+3個提取，多出的一個是甲型流感病毒H1亞型的PC（樣品制備陽性對照），一個是甲型流感病毒N1亞型的PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 mL第一步和第二步所得的4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此分別作為兩個PC。另外用水作為NC，水的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。注意：本試劑盒采用DNA作為陽性對照，不能有效監控核酸純化和RT過程。如果需要RNA模板，需要另外定做。

9.                      用自選方法純化樣品的RNA。本試劑盒跟市場上大多數RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

三、Probe qRT-PCR反應（20 mL體系，在樣品制備室進行）

10.                      如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+3+1+6+6個RT-PCR管，其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于甲型流感病毒H1亞型的標準曲線，另外6個用于甲型流感病毒N1亞型的標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+3+3個RT-PCR管，其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于甲型流感病毒H1亞型RT-PCR陽性對照，1個用于甲型流感病毒N1亞型RT-PCR陽性對照（直接用第一步和第二步所得的兩個4號稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

11.                      在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復）：

12.                      蓋上蓋子后上機，按下面參數進行RT-PCR：

四、數據處理

13.                      如果擴增陽性對照或制備陽性對照結果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數據，需要重做擴增或制備或跟廠家聯系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系，購買新的引物和探針。

14.                      如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進入后續分析。

15.                      對定量檢測，以標曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以甲型流感病毒H1亞型陽性對照（FAM通道）和甲型流感病毒N1亞型陽性對照（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制兩條標準曲線，r2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從分別從兩條標準曲線上推算出對應樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

16.                      對定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對照FAM通道的熒光信號必須有對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于35。對待測樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為甲型流感病毒H1亞型陰性，如果小于或等于35則為甲型流感病毒H1亞型陽性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40則為甲型流感病毒N1亞型陰性，如果小于或等于35則為甲型流感病毒N1亞型陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

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